维普资讯 http://www.cqvip.com ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＮＡＴＯＭＹ Ｖｏ１．３０ Ｎｏ．２ ２００７ 解剖学杂志２００７年第３Ｏ卷第２期 Ｄ一谷氨酸与帕金森模型鼠发病相关性研究 刘承伟 卢 洁 卢 昕 △ 马文领。 蔡懿灵。 （１桂林医学院解剖学教研室，桂林５４１００４；２广西师范大学化学化工学院，桂林２００４３３） ５４１００４； ３第二军医大学海军医学系卫生学教研室，上海摘要 目的：观察帕金森模型鼠中脑Ｄ一谷氨酸的变化睛况，探讨兴奋性神经递质右旋对映体对谷氨酸能神经元的损 伤作用以及与帕金森发展过程的相关性。方法：成年Ｃｓ ＢＬ雄性小鼠随机分为对照组、模型组。模型组腹腔注射１一 甲基一４一苯基一１．２．３．６一四氢吡啶（１－ｍｅｔｈｙｌ一４一ｐｈｅｎｙｌ一１．２．３．６一ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｈｒ．ｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）制备帕金森病模型鼠。采用 柱前衍生高效液相色谱方法检测中脑Ｄ一谷氨酸含量，采用免疫组织化学ＡＢＣ法观察黑质和尾壳核谷氨酸能神经元 的变化。结果：与对照组相比，模型组动物注射ＭＰＴＰ １ ｄ后中脑组织中Ｄ一谷氨酸含量明显升高，３ ｄ后逐渐降低；３ ｄ 后谷氨酸能神经元数量明显减少。结论：中脑组织中Ｄ一谷氨酸可能具备与Ｌ型对映体相同的兴奋毒性，并参与帕金 森的发病机制。 关键词帕金森病；Ｄ一谷氨酸；高效液相色谱；小鼠 Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｉｃｅ Ｌｉｕ Ｃｈｅｎｇｗｅｉ ，Ｌｕ Ｊｉｅ ，Ｌｕ Ｘｉｎ 。Ｍａ Ｗｅｎｌｉｎｇｓ，Ｃａｉ Ｙｉｌｉｎｇ。 （１ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＡｎａｔｏｍｙ，ＧｕｉｌｉｎＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｃｈｉａ；２ Ｃｏｌｎｌｅｇｅ ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｃｈｉａ；３ Ｄｅｐａｒｔｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｈｙｇｉｅｎｅ， Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｎａｖａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ（Ｄ－Ｇｌｕ）ｏｎ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｄ－Ｇｌｕ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ＰＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａｄｕｌｔ Ｃ５７ＢＬ ｍａｌｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＰＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ＰＤ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂ— ｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＭＰＴＰ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｄ－Ｇｌｕ ｉｎ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒ— ｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ Ｇｌｕ－ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ Ｎｉｇｒａ ａｎｄ Ｎｕ．ｏｆ ｃａｕｄａｔｅ－ｐｕｔａｍｅｎ ｗｅｒｅ ｏｂ— ｓｅ￣ｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｆｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＰＴＰ。Ｇｌｕ－ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｂｕｔ Ｄ－Ｇｌｕ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ： Ｄ－Ｇｌｕ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｎ Ｇｌｕ－ｎｅｕｒｏｎｓ ａｓ Ｌ－Ｇｌｕ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ＰＤ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ；ＨＰＬＣ；Ｃ５７ＢＩ ｍｏｕｓｅ 游离的兴奋性氨基酸手性对映体的存在已经在 氨基酸为主，其对映体 氨基酸含量甚微，Ｄ型对映 体是否具有与Ｌ型对映体相同的兴奋毒性，并参与 帕金森（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）发病机制则仍未能 得知。本研究应用ＭＰＴＰ制作了帕金森鼠模型，探 讨了Ｄ－Ｇｌｕ对Ｇｌｕ能神经元毒性作用。 １材料和方法 １．１ ＰＤ模型动物的分组与制作 生命科学领域得到广泛的认同。右旋（Ｄ型）氨基酸 不仅伴随着生命的整个周期，而且发现其与一些疾 病的发生密切相关。研究表明谷氨酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ， Ｇｌｕ）及其受体可能参与了黑质纹状体系统多巴胺能 神经元的变性过程［１］。Ｓｏｎｓａｌｌａ的研究小组首次探 索了兴奋性氨基酸是否参与了１一甲基一４一苯基一 １．２．３．６一四氢吡啶（１一ｍｅｔｈｙｌ一４一ｐｈｅｎｙｌ一１．２．３．６－ｔｅｔ— ｒａｈｙｄｒ０ｐｈｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）损毁神经元［ 。随后的大 雄性Ｃｓ ＢＬ小鼠５０只（由第二军医大学实验动 量研究证实，Ｇｌｕ在多巴胺（ＤＡ）神经元的损毁过程 中具有兴奋毒性作用＿３ ］。由于哺乳动物脑内以Ｌ一 ＊广西自然科学基金资助课题（桂科自Ｏ４４７１ＯＯ） △通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｘｉｎ－ｃｈｅｍ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ 收稿日期：２００６—０９—０４；修回日期：２００６—１２—２２ 物中心提供），体质量２０￣２２ ｇ，随机分成２组，即对 照组（ 一ｌＯ）、ＰＤ模型组（ 一４０）。ＰＤ模型组 每日上午腹腔注射ＭＰＴＰ（３０ ｍｇ／ｋｇ，Ｓｉｇｍａ公司）， 分别于用药１、３、５、７ ｄ后，每组每个时间点分别取 ５只小鼠经心灌注进行免疫组织化学研究，另５只断 维普资讯 http://www.cqvip.com 头后取脑进行Ｄ—ｇｌｕ含量的测定。对照组：正常摄取 食水，每日上午腹腔注射与ＭＰＴＰ等量的生理盐水， 于第７天取５只小鼠经心灌注进行免疫组织化学研 究，另５只断头后取脑进行Ｄ—Ｇｌｕ含量的测定。 １．２免疫组织化学方法 小鼠分别给药１、３、５、７ ｄ或注射生理盐水７ ｄ 后，每组取５只在过量戊巴比妥钠（１００ ｍｇ／ｋｇ）腹腔 麻醉下，先经心灌注生理盐水２０ ｍｌ，再经７５ 苦味 酸和０．２ 多聚甲醛磷酸缓冲液（ｐＨ值７．４）灌注固 定。取脑，后固定２４ ｈ，再浸入３０ 蔗糖磷酸缓冲 液（ｐＨ７．４）内直到组织块沉底。依照图谱【５］，取含 有黑质和尾壳核的脑段，冰冻冠状切片，片厚 ２０ ｇｍ。２ 正常兔血清封闭切片３０ ｍｉｎ，以阻断非 特异反应。１：５００ｄ￣鼠ＩｇＭ抗磷酸化的谷氨酰胺 合成酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＰＡＧ）抗体 （日本东京大学金子武嗣教授惠赠）４℃孵育２４ ｈ， １：２００羊抗小鼠ＩｇＭ室温孵育３ ｈ，１：５００ Ａｖｉｄｉｎ－ ＦＩＴＣ孵育３ ｈ，各步之间用ＰＢＳ充分洗涤。裱片， 干燥，甘油和ＰＢＳ（１：１）混合液封片。激发波长 ４９０ ｎｍ，落射光荧光显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＢＸ－６０）在 ＷＧ镜组下观察。 １．３ 中脑组织预处理 小鼠分别给药ｌ、３、５、７ ｄ或注射生理盐水７ ｄ 后，每组取５只脱颈椎处死，迅速剥取全脑，于 一８０℃冰箱保存待用。依照上述图谱【ｓ］，取视交叉 与下丘之间的中脑，沿中脑水管的腹侧作冠切，取其 腹侧中脑组织并称重。以脑质量（ｍｇ）：体积（ｍ１）为 １：５比例分２次加人预冷０．１ ｍｏｌ／Ｉ ＨＣ１匀浆，超 声波振荡５ ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ（４℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ）。 合并２次上清液以１．５倍体积加入乙腈除蛋白，上清 液用氮气小心吹干，残渣加入２００，ｕｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ硼砂 （ｐＨ一１０）溶解，０．４５ ｇｍ滤膜过滤，～１８℃保存 待测。 １．４中脑 Ｇｌｕ含量的测定 仪器：ＬＣ－１ＯＡＴ高效液相色谱仪，Ｓｈｉｍ—ｐａｃｋ ＶＰ＿ｏＤＳ色谱柱２５０ ｍｍＸ４．６ ｍｍ（日本岛津公司）。 试剂：邻苯二甲醛（０ＰＡ）、Ｎ一异丁酰一Ｌ一半胱氨酸 （ＩＢＬＣ，Ｆｌｕｋａ公司），Ｄ—Ｇｌｕ（Ｓｉｇｍａ公司）；甲醇为色 谱纯，其余试剂均为分析纯，水为亚沸水。 样品衍生：分别称取８ ｍｇ ＯＰＡ，２３ ｍｇ ＩＢＬＣ，以 ５００ ｌ甲醇混合均匀后于４￣Ｃ保存。Ｄ－Ｇｌｕ标准液 用硼砂（ｐＨ一１０）配成０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的储备液，用时稀 释成所需浓度。依次取５０ ｌ ＯＰＡ，５０ ｌ ＩＢＬＣ， １９０ ｌ硼砂（０．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝１０），１０ ｌ标准液或样 液混合于聚丙烯管中，旋涡振荡器混合３０ Ｓ，反应 ５ ｍｉｎ后进样１０ ｌ。 色谱条件：流动相Ａ为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠溶 一】３８一 液，流动相Ｂ为甲醇乙腈混合液（ ：Ｖ一４５：５５）； 梯度程序：０～２５ ｍｉｍ，５．５ ９／６～１５．５ ９／６Ｂ。荧光检测 波长：入Ｅ 一３４０ ｎｍ，入Ｅｍ一４４５ ｎｍ。定量方法：工作 曲线法。 １．５统计学处理 采用方差分析进行各实验组与对照组的比较。 ２结果 ２．１行为学观察 正常对照组小鼠在实验过程中，反应灵敏，摄食 正常，无明显异常表现；模型组小鼠于ＭＰＴＰ注射 ３ ｍｉｎ后出现前肢抬举伴震颤、向一侧旋转、竖毛和频 繁的窜蹦等动作，持续约２０ ｍｉｎ左右，接着出现短暂 性活动减少。在此后的每次ＭＰＴＰ注射后，上述症 状表现越来越明显，特别是第３天后，上述症状尤为 突出。 ２．２免疫组织化学染色结果 对照组黑质和尾壳核可见到大量ＰＡＧ阳性神 经元，均为小到中等大小卵圆形神经元，ＭＰＴＰ注射 １ ｄ后ＰＡＧ阳性神经元的数量和形态变化不大，３ ｄ 后ＰＡＧ阳性神经元数量明显减少，７ ｄ后黑质神经 元减少更为明显，染色也明显变淡，尾壳核神经元数 量也明显减少（附图）。 ２．３ Ｇｌｕ含量测定结果 对照组小鼠中脑内Ｄ—ｇｌｕ含量为（７．４７±１．０６） ｎｍｏｌ／ｇ。与对照组相比，Ｄ－Ｇｌｕ含量在ＭＰＴＰ注射 １ ｄ后增高到（１４．０５±２．３８）ｎｍｏｌ／ｇ（Ｐ＜０．０１）， ３ ｄ后有所下降，为（１１．５８±２．３６）ｎｍｏｌ／ｇ，５ ｄ和７ ｄ 后进一步下降到（１０．５０±２．５２）ｎｍｏｌ／ｇ和（１０．１８± ２．０４）ｎｍｏｌ／ｇ，但仍高于对照组（Ｐ＜０．０５）。 ３讨论 研究发现，单个囊泡的释放能使突触间隙内的 Ｇｌｕ浓度大幅升高，足以使突触后受体和Ｇｌｕ的结合 达到饱和；接着Ｇｌｕ的浓度迅速降低，时间常数仅为 １．２ ｍｓ＿６Ｊ。本实验显示，与对照组相比，模型１ ｄ和 ３ ｄ组小鼠中脑组织中Ｄ—Ｇｌｕ浓度显著升高，１ ｄ组升 高最为明显，而后逐渐降低。研究表明ＰＤ病变过程 中大量的Ｇｌｕ在突触间隙聚集，可以与突触后膜 ＮＭＤＡ受体结合，钙离子内流增加，从而导致胞内钙 离子浓度超载，升高的钙离子浓度引起复杂的生物 化学级联反应，最终导致神经细胞死亡。由于细胞 外液缺乏Ｇｌｕ水解酶系统，突触间隙中Ｇｌｕ清除和 失活的惟一途径是通过神经末梢和胶质细胞高亲和 力谷氨酸转运体主动重摄取，终止其神经毒性作用。 可见，谷氨酸转运体在ＰＤ病变过程中起着重要 作用。 维普资讯 http://www.cqvip.com
