(19)中华人民共和国国家知识产权局
*CN102229681A*
(10)申请公布号 CN 102229681 A(43)申请公布日 2011.11.02
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110169071.0(22)申请日 2011.06.22
(71)申请人郓城绅联生物科技有限公司
地址274700 山东省菏泽市郓城县工业园区(72)发明人谢成君 甄爱华 刘建洋(74)专利代理机构济南泉城专利商标事务所
37218
代理人张贵宾(51)Int.Cl.
C08B 37/10(2006.01)C12S 3/02(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 5 页
(54)发明名称
一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法(57)摘要
本发明公开了一种从猪小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法，特别公开了一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法。该利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：肠粘膜的制备、酶解、吸附、洗脱、沉淀脱盐和脱水干燥即得肝素钠。因此，本发明的有益效果是：收率高，肝素钠活性损失小，质量稳定，废液排放无污染且能循环使用，采用车间废气净化处理装置，解决了肝素钠车间气味恶臭的问题；利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠，需要2000～2400根猪小肠，而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠，只需要1400～1600根猪小肠，且肝素钠效价和活性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，利润可提高40％以上。CN 102229681 ACN 102229681 ACN 102229682 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：（1）肠粘膜的制备：在猪小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；（2）酶解：用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为1：7-9，搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3%-5%的肠衣专用盐，测其盐度达到2%-2.5%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用80目尼龙布过滤，收集过滤液；
（3）吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，搅拌8-10小时，继续冷却到40℃-45℃，放出废液，收集过滤树脂；
（4）洗脱：（4-1）：将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中，加入质量分数为5%-7%的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌30-40分钟；
（4-2）：随后将废液倒掉，加入质量分数为20%-24%的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
（4-3）：重复（4-2）的步骤，将两次收集的洗脱液合并待用；（5）沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%-85%的乙醇，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干脱水，放入烘箱干燥后即得肝素钠。2.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（2）酶解中粘膜与2709碱性蛋白酶的重量比为500：1。
3.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（3）吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30克树脂的比例添加。
4.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（4-1）中树脂与加入的质量分数为5%-7%盐水的重量比为1∶1.1-1.3，步骤（4-2）中树脂与加入的质量分数为20%-24%盐水的重量比为1∶1.1-1.3。
5.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（4-3）收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为20%-24%的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌30-40分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。
6.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（5）沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。
7.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（5）沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1：1.8-2.2。
8.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤（6）脱水干燥中烘箱的温度为80℃-90℃，干燥时间为6-8小时。
2
CN 102229681 ACN 102229682 A
说 明 书
一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法
1/5页
[0001] （一）技术领域
本发明涉及一种从猪小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法，特别涉及一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法。[0002] （二）背景技术
肝素是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多糖，主要存在与肥大细胞中，具有抗凝血作用，被广泛用于手术和脑血栓、心肌梗死等的治疗。肝素的分子量大约3000—37500，对商品肝素的研究提示至少有21种分子个体。肝素钠是肝素的钠盐。肝素钠作为天然抗凝血物质受到世界各国的重视．也是我国主要的出口药物之一．随着研究的深入，人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形成和调节血脂的作用，还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能。目前，肝素钠主要是从猪、羊小肠黏膜和牛肺、腌肠衣盐水等中提取。研究显示肝素钠在是猪小肠粘膜中含量最高。肝素钠粗品是我国的传统出口产品，在国际上占有重要的地位。但是传统生产工艺落后，肝素钠产率低，肝素钠产品质量不稳定，生产过程中资源浪费严重，污染环境严重。[0003] （三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种收率高、肝素钠活性损失小的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法。
[0004] 本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：（1）肠粘膜的制备：在猪小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；（2）酶解：用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为1：7-9，搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3%-5%的肠衣专用盐，测其盐度达到2%-2.5%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用80目尼龙布过滤，收集过滤液；
（3）吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，搅拌8-10小时，继续冷却到40℃-45℃，放出废液，收集过滤树脂；
（4）洗脱：（4-1）：将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中，加入质量分数为5%-7%的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌30-40分钟；
（4-2）：随后将废液倒掉，加入质量分数为20%-24%的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
（4-3）：重复（4-2）的步骤，将两次收集的洗脱液合并待用；（5）沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%-85%的乙醇，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干脱水，放入烘箱干燥后即得肝素钠。[0005] 步骤（2）酶解中粘膜与2709碱性蛋白酶的重量比为500：1。
3
CN 102229681 ACN 102229682 A[0006]
说 明 书
2/5页
步骤（3）吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30克树脂的比例添加。[0007] 步骤（4-1）中树脂与加入的质量分数为5%-7%盐水的重量比为1∶1.1-1.3，步骤（4-2）中树脂与加入的质量分数为20%-24%盐水的重量比为1∶1.1-1.3。[0008] 步骤（4-3）收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为20%-24%的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌30-40分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。[0009] 步骤（5）沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。[0010] 步骤（5）沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1：1.8-2.2。[0011] 步骤（6）脱水干燥中烘箱的温度为80℃-90℃，干燥时间为6-8小时。[0012] 上述步骤（3）吸附中，所加树脂为德国拜耳树脂；步骤（4）洗脱中，盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。[0013] 为了使粘膜刮制容易，常习惯将小肠浸泡24-48小时,这样能保护肠衣免受破损，但长时间浸泡会发酵产生肝素酶，分解肝素钠，此外发酵还会产生一些有害物质，使树脂中毒，因此在浸泡时间上一定要准确把握，夏季适当缩短时间，冬季可适当延长时间，在弱碱性或质量分数为4％的盐水条件下，能减缓微生物的发酵和抑制肝素酶活性，可以放于低温处作短期贮存。
[0014] 乙醇沉淀时，必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇，以避免局部乙醇浓度突然增高，而且乙醇要用预冷过的，否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏，从而降低其活性。[0015] 酶解、吸附肝素钠过程中的废液(煮锅废水)，气味恶臭，致使生产车间空气环境及其混乱，使人难以忍受，甚至影响工作人员的身心健康。为此本发明采用车间废气净化处理装置，大大减少了空气中的恶臭气味，极大改善了工作环境。[0016] 因此，本发明的有益效果是：收率高，肝素钠活性损失小，质量稳定，废液排放无污染且能循环使用，采用车间废气净化处理装置，解决了肝素钠车间气味恶臭的问题；利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠，需要2000～2400根猪小肠，而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠，只需要1400～1600根猪小肠，且肝素钠效价和活性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，利润可提高40％以上。[0017] （四）具体实施方式
实施例1：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：（1）肠粘膜的制备：
取400根猪小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净；将肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜420千克；
（2）酶解：打开粘膜泵，将420千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将3360千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为50r/min，搅拌均匀，再加入840克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为8.0；打开蒸汽阀门使温度达到55℃，加入150千克肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5%，保温2小时；恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到80℃，停止加温，保温30分钟；保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
（3）吸附：
4
CN 102229681 ACN 102229682 A
说 明 书
3/5页
将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为50r/min，使罐中的温度自然降到58℃，保持溶液的PH值为8.0，盐度2.5%；将10千克树脂加入吸附罐中，搅拌8小时；自然冷却温度到45℃，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂；
（4）洗脱：（4-1）：将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为5%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在50℃，开启搅拌机转速为30r/min，搅拌30分钟；
（4-2）：随后将废液倒掉，加入质量分数为22%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在50℃，开启搅拌机转速30r/min，搅拌3小时后，收集洗脱液；
（4-3）：重复（4-2）的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；（步骤（4-3）收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为22%的盐水，温度保持在50℃，开启搅拌机转速30r/min，搅拌30分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；）（5）沉淀脱盐：
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到40％，调PH值至7.0，搅匀密封沉淀24小时；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：
将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在80℃下用蒸汽干燥6小时，烘干即得肝素钠。[0018] 实施例2：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：（1）肠粘膜的制备：
取300根猪小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净；将肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜310千克；
（2）酶解：打开粘膜泵，将310千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将2790千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为55r/min，搅拌均匀，再加入620克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为8.0；打开蒸汽阀门使温度达到58℃，加入93千克肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5%，保温2.5小时；恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到82℃，停止加温，保温35分钟；保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
（3）吸附：
将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为55r/min，使罐中的温度自然降到59℃，保持溶液的PH值为7.5，盐度2.5%；将9千克树脂加入吸附罐中，搅拌9小时；自然冷却温度到42℃，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂；
（4）洗脱：（4-1）：将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为6%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在52℃，开启搅拌机转速为35r/min，搅拌35分钟；
5
CN 102229681 ACN 102229682 A
说 明 书
4/5页
（4-2）：随后将废液倒掉，加入质量分数为20%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在52℃，开启搅拌机转速35r/min，搅拌3.5小时后，收集洗脱液；
（4-3）：重复（4-2）的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；（步骤（4-3）收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为20%的盐水，温度保持在52℃，开启搅拌机转速35r/min，搅拌35分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；）
（5）沉淀脱盐：
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为82%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到42％，调PH值至7.5，搅匀密封沉淀23小时；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：
将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在85℃下用蒸汽干燥7小时，烘干即得肝素钠。[0019] 实施例3：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：（1）肠粘膜的制备：
取500根猪小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净；将肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜520千克；
（2）酶解：打开粘膜泵，将520千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将30千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为60r/min，搅拌均匀，再加入1040克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为9.0；打开蒸汽阀门使温度达到60℃，加入208千克肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5%，保温3小时；恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到85℃，停止加温，保温40分钟；保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
（3）吸附：
将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为60r/min，使罐中的温度自然降到60℃，保持溶液的PH值为8.0，盐度2.5%；将10千克树脂加入吸附罐中，搅拌10小时；自然冷却温度到45℃，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂；
（4）洗脱：（4-1）：将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为7%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在55℃，开启搅拌机转速为40r/min，搅拌40分钟；
（4-2）：随后将废液倒掉，加入质量分数为24%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在55℃，开启搅拌机转速40r/min，搅拌4小时后，收集洗脱液；
（4-3）：重复（4-2）的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；（步骤（4-3）收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为24%的盐水，温度保持在55℃，开启搅拌机转速40r/min，搅拌40分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；）
（5）沉淀脱盐：
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为85%的预冷过的乙醇，加入乙
6
CN 102229681 ACN 102229682 A
说 明 书
5/5页
醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到45％，调PH值至8.0，搅匀密封沉淀25小时；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：
将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在90℃下用蒸汽干燥6小时，烘干即得肝素钠。[0020] 上述步骤（3）吸附中，所加树脂为德国拜耳树脂；步骤（4）洗脱中，盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。
7
