真核细胞RNA的分离和鉴定

一、实验目的

1、掌握用盐溶法从动物组织中提取核酸的原理的操作技术及方法 2、掌握核酸鉴定和定量分析的原理与方法 3、了解定性鉴定核酸的原理和方法。 。

二、实验原理

1.核酸制备。根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核糖释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸提取出来，达到分离目的。

根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。

在0.14mol/L 的氯化钠溶液中，RNA 核蛋白溶解度大，而DNA 核蛋白溶解度较小；相反，在1mol/L 的氯化钠溶液中，DNA 核蛋白溶解度最大，而RNA 核蛋白溶解度却很小。核蛋白分离后可用蛋白变性沉淀剂（氯仿＋异戊醇、十二烷基硫酸钠（SDS），热酚等）去除蛋白，释放核酸。去除蛋白后的核酸溶液加入1.5～2倍体积的95%乙醇，核酸便从溶液中析出。

2.RNA鉴定——定糖法

RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 -二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物。其最大吸收峰波长为 670nm ，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。

动物肝中含有核糖核酸酶（RNase）和脱氧核糖核酸酶（DNase），因此要保持低温，防止Mg2+、Fe2+及Co2+等激活离子。

三、试剂与仪器

新鲜牛肝；地衣酚试剂：（100mg地衣酚+100ml浓盐酸+100mgFeCl3﹒6H2O）；0.14mol/L氯化钠溶液（含0.01M柠檬酸）；95%乙醇；氯仿；异戊醇等

离心机，721型分光光度计，胶头滴管，离心管，烧杯，玻璃棒，试管，比色皿，移液，移液管等

四、试验方法 1.制备肝组织匀浆

称取新鲜牛肝或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L的氯化钠溶液洗去血水，用不锈钢置于研钵中加入细沙少许，充分研磨制备成匀液，加入等量的生理盐水。 2、分离抽提：

①将肝匀浆倒入离心管内，立即加入2％三路醋酸4ml，用玻璃棒搅拌，然后静止3分钟，离心3500转每分钟，离心2分钟。

②、倾去上层酒精液，在沉淀中加入10％NaCl溶液4ml搅匀，再置于沸水中加热8分钟，并用玻璃棒不断搅拌，取出冷却后在离心（3500转每分钟，2分钟）。

③、将上清液倒入小烧杯内，取等量的95％乙醇，逐步滴加小烧杯内，边加边摇匀，即可见到白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后，将小烧杯内容物倒入离心管，离心（3500转每分钟，2分钟）。

④、倾倒上清液即得到核酸钠的白色沉淀。在含核酸的离心管内，加入5％硫酸，4ml，用玻璃棒搅匀，在沸水溶液中加热8分钟即可。 3、RNA成分的鉴定。 取三支试管，标号，按下表操作。 试剂 样品液 蒸馏水 标准 地衣酚 测定管 0.1 1.9 — 4.0 标准管 — — 2.0 4.0 空白管 — 2.0 — 4.0 将各管混匀，放入沸水浴中加热 25min ，冷却后于 670nm 测定其吸光度值。 样品液中 RNA 含量的计算公式如下：

样品液RNA 含量（μｇ/ml ）

注意事项：

1、在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下（0℃左右）进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。

2、加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA 断裂。 3、要学会正确使用离心机，离心后，注意上清液和沉淀的取舍。