不同理化因子组合对长春花悬浮培养的研究

不同理化因子组合对长春花悬浮培养的研究

摘 要：实验研究了不同种类、不同浓度的植物生长调节物质组合和其他四种理化因子对长春花悬浮培养细胞生长的影响。以前的实验结果表明：单因子以 2，4-D效果最好。其中以2，4-D的最佳浓度为0.5mg/L。而本次实验的结果表明:组合因子比单因子更有利于细胞的生长，以0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA为最佳。在其它的四种理化因子中，1/2MS、MS和B5培养基有利于细胞的生长。蔗糖的最佳浓度为30g/L；葡萄糖在研究范围内随着浓度的增加，生长速度也在增加。最适于长春花的PH值为5.0-5.4。

关键词：长春花 细胞悬浮培养 植物生长调节物质 理化因子

一、引言

长春花（Catharanthus roseus(L.) G. Don）属于夹竹桃科（Apocynaceae）长春花属[1]。为多年生草本。原产于非洲东南部，现在我国各地均有栽培。长春花用途广泛，主要含具有抗肿瘤作用的生物碱——长春碱和长春新碱等[2]。长春花组织和细胞培养的研究已经有很多年，多数应用于大量细胞生产和植物的再生，以成分分析、提取为主，应用于次生代谢产物的提取却很少[3]。

长春花的悬浮培养的就是植物细胞工业化的必经步骤和固体培养基相比，细胞悬浮培养具有繁殖速度快、能大规模培养和提供大量均匀一致的植物细胞培养物的特点。然而长春花细胞的悬浮培养技术并不完善，在国内外很少有此类报道。悬浮细胞培养受到许多外界条件的影响。如激素、温度、光照、营养、PH值等。本文就这方面选取了不同的植物生长调节物质种类、浓度组合以及其他的四种理化因子来培养悬浮细胞，以便获得细胞快速增殖的最佳培养条件。

二、材料与方法

1．材料

长春花（Catharanthus roseus(L.) G. Don）取自中科院武汉植物园

2．愈伤组织的诱导

取春天4月份的长春花幼嫩的叶片，为诱导及大量繁殖，必须对外植体进行挑选[4]，用自来水冲洗1-2个小时，滤纸吸干，用75%的酒精侵泡30S后，用0.1%的升汞消毒8min，无菌水冲洗数遍。切成0.5cm×0.5cm 的小块。接种于含0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA（本文所用的生长调节剂购于上海，配成1mg/mL的母液）、琼脂7g/L、蔗糖30g/L的MS固体培养基上（PH=5.8，高压灭菌）在光强为40ｕmol/ms 12-14h/d.温度为25±2℃条件先诱导[5]。

3．愈伤组织的筛选及细胞悬浮系的建立[6]

诱导出的愈伤组织接种于含50ml固体培养基的150ml的三角瓶中，每瓶的接种量约3g。愈伤组织每25天继代一次。经3-5次继代后，选择生长均一、质地疏松、分散性好的愈伤组织转入液体培养基中。每150ml三角瓶中分装40ml的液体培养基（同上的固体培养基去掉琼脂，以下的实验没有特别说明的都是该种培养基）。每次接种量约为2g。悬浮培养采用旋转式摇床，转速为120r/min。置于光照下培养。

4．细胞干重的测定

细胞悬浮周期为25天。培养结束后，经减压过滤后测其鲜重。然后收集培养物置于60℃烘箱中烘干至恒重称其干重。换算成每天每升培养基增加的细胞干重毫克数，即mg/Ld.表示细胞的生长速度。实验重复三次，取其平均值计算结果。

三、结果与讨论

1．激素组合对长春花细胞悬浮培养生长的效应

（1） 2，4-D和6-BA组合对培养细胞生长的效应

表4 2，4-D和NAA组合对培养细胞生长的效应

2，4-D（0.5）+6-BA x（mg/L）

0.05

0.1

0.2

0.5

1.0

2.0

5.0

干重增加（mg/L）

2352

5008

8200

10109

6095

5832

4000

生长速度（mg/Ld）

95

201

328

405

244

234

160

由表4可以看出，2，4-D和6-BA组合使用比单独一种更有利于细胞的生长。当组合中6-BA在0.05-0.5范围内，细胞生长速度随着浓度的增加而增加。在0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA时，细胞的生长速度最快。而在6-BA在0.5-2.0mg/L时，随着 6-BA的增加，其生长速度不断地下降。

（2）2，4-D、NAA和6-BA组合对培养细胞生长的效应

表5 2，4-D、NAA和6-BA组合对培养细胞生长的效应

2，4-D（0.5）+NAA（0.5）+ 6-BAx（mg/L）

0.05

0.1

0.2

0.5

1.0

2.0

5.0

干重增加（mg/L）

2503

4313

6532

9205

9826

10294

8653

生长速度（mg/Ld）

101

173

262

369

394

412

347

由表5可以看出：2，4-D、NAA和6-BA三种激素组合时，更有利于细胞培养的生长，且在研究范围内较单因子有着更明显的效果。在研究范围内的最佳浓度为0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA。

2．其他理化因子对长春花悬浮培养细胞生长的效应

（1）不同种类培养基对对培养细胞生长的效应

在长春花细胞的悬浮培养中，分别采取了1/4MS、1/2MS、MS、B5、White、N6六种不同的培养基〔6〕，实验结果如下：

表6 不同种类培养基对对培养细胞生长的效应

培 养 基 种 类

1/4MS

1/2MS

MS

B5

White

N6

干重增加（mg/L）

9776

12526

10294

11328

8310

死亡

生长速度（mg/Ld）

392

501

412

454

333

——

由表6可以看出1/2MS、MS和B5培养基对细胞的生长比较适合。而在N6培养基中细胞全部死亡。在不同培养基中的细胞生长的速度情况不同是由于作为氮源的状态不同，含量不同所造成的。

（2）不同蔗糖浓度对细胞生长的效应

表7 不同蔗糖浓度对细胞生长的效应

不同蔗糖浓度（g/L）

0

10

20

30

40

50

干重增加（mg/L）

死亡

2587

5278

10294

9775

7829

生长速度（mg/Ld）

——

104

212

412

391

314

由表7可以看出，在MS培养基中，随着蔗糖浓度的升高，生长速度逐渐增大，说明在低浓度时，糖是细胞生长的性基质〔7〕。甘焕远等〔8〕在总结前人和自己的工作的基础上提出了培养基中蔗糖常常是使培养物生长达到最高的碳源。同时还发现随着糖浓度的增加会导致干重的增加，而细胞数量并不显著增加[9]。实验也证明了蔗糖的浓度为30g/L时，细胞生长最快。低于或高于此浓度，其细胞生长速度都将下降。

（3）不同葡萄糖浓度对细胞生长的效应

表8 不同葡萄糖浓度对细胞生长的效应

不同葡萄糖浓度（g/L）

0

10

20

30

40

50

干重增加（mg/L）

死亡

2150

4415

6040

7281

8801

生长速度（mg/Ld）

——

87

177

242

292

353

由表8和上面两个示意图可以看出，在MS培养基中，在实验所研究的范围内，随着葡萄糖浓度的升高，细胞生长速率随之增加。而且较之于蔗糖相比，增长更明显。此外还发现葡萄糖下的愈伤组织比蔗糖下的要疏松、均匀而且细小颗粒多。

（4）不同PH值对细胞生长的效应

表9 不同PH值对细胞生长的效应

不同PH值

3.8

4.2

4.6

5.0

5.4

5.8

6.2

6.6

干重增加（mg/L）

4734

5948

8597

12808

16741

10294

7224

4636

生长速度（mg/Ld）

190

238

344

513

550

412

2

186

由表9和上面两个示意图可以看出：PH值对细胞的生长影响十分明显。在研究范围内PH值在5.0-5.4时最适于长春花细胞的生长。PH值过大或过小都对愈伤组织的生长产生明显的抑制，在整个实验过程中培养基的PH值在小范围内呈先降低后升高的变化趋势[10]，这种变化趋势主要是由于NO3-和NH4+之间供应和吸收的不平衡[11]。在研究范围内的最适PH值为5.4。

四、结论

从以上的实验部分可以看出：不同的理化因子对长春花培养细胞有不同的影响。其中植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物细胞培养起着重要而明显的调节作用，本实验的结果也得到了验证。植物生长调节物质的种类以及浓度对不同的植物有着不同的效果。在长春花细胞的悬浮培养中，组合因子比单因子更有利于细胞的生长，以0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA效果最佳，细胞生长速度最快。从结果可以看出不是植物生长调节物质的浓度越高、种类越多效果就越明显。对不同的植物应选择相应的种类和适宜的浓度。另外，不同的培养基在长春花细胞的悬浮培养中也有不同的效果。这主要是由于培养基的组分不同。其中1/2MS、MS和B5这三种培养基较有利于细胞的生长。这可能是由于这三种培养基中的氮元素相对于其他的培养要少一些的原因，而更有利于长春花细胞的生长。蔗糖和葡萄糖是培养基中碳素和能量物质的来源。同时对保持培养基的渗透压也有重要的作用。但在培养基中糖的含量不宜过高，一般在2-4%为宜。PH值是细胞培养的重要的外界环境，对细胞的生长起着重要的作用，不宜过高也不宜过低，本实验研究的长春花的最适PH值为5.0-5.4。